KCNQ1通道外部K+灵敏度的机制，通道表达式如何列出？

文|孤馆深深

编辑|孤馆深深

前言

KCNQ1电压门控K+通道参与多种基本生理过程，并表现出被外部K+明显抑制的独特特征，尽管这种调节机制在不同的生理和病理过程中具有潜在作用 ，但其确切基础尚不清楚。

材料和方法

通过重叠PCR方法以及使用QuickChange试剂盒（Stratagene） 引入克隆到卵母细胞表达载体pGEM-He-Juell中的人KCNQ1基因突变，每个突变都通过DNA测序进行验证 ，mRNA合成使用T7 mMessage mMachine转录试剂盒（Ambion）进行的。

然后在凝胶电泳中分析 mRNA，并通过 RNA 6000 纳米试剂盒（安捷伦科技公司）或光谱法进行定量，EQQ结构如前所述生成，它使用HindIII和XbaI限制性位点亚克隆到pGem He-Juell载体中，所有新构建体均通过测序得到证实。

通道表达式

根据当地动物福利当局的指导方针 ，非洲爪蟾（Nasco）被饲养在亚美尼亚共和国国家科学院分子生物学研究所的动物设施中，手术去除卵母细胞，并在Ca中用2-3mg / ml胶原酶（罗氏）去卵泡2+-不含 OR2 溶液，含有 82.5 mM NaCl、2 mM KCl、1 mM MgCl2和 5 mM HEPES，pH 7.5。

选择IV期或V期卵母细胞并在第二天注射2-50ng cRNA，使用卵母细胞手动显微注射移液管（Drumond科学公司）进行注射，注射前制备不同摩尔比为α β的KCNQ1/KCNE1、KCNQ1/KCNE2和KCNQ1/KCNE3 cRNA的混合物。

注射后2-7 d进行电生理实验，将卵母细胞在补充有2mM CaCl的OR2溶液中孵育2、5 mM 丙酮酸钠和 50 mg/ml 庆大霉素在电生理记录前在 17°C 条件下。

对于单通道记录，如前所述，将ltk-小鼠成纤维细胞（LM）培养并铺板用于实验（Murray等人，2016），根据制造商的方案，使用Lipofectamine2000（赛默飞世尔科技）转染细胞 ，EQQ构建体以2：0.7的比例（微克）转染GFP，F339A被GFP标记并在1.5μg/培养皿的细胞中单独转染。

电生理记录

TEVC记录在室温下使用Tec-03X或Turbo TEC-05放大器（NPI电子）连接到Patchmaster软件（HEKA Electronics）进行 ，使用Instrutec数字化仪进行数据采集和监控，一些实验是在基于Axon 500B放大器（分子设备）的设置中进行的，该放大器通过ITC-16计算机接口（端口）连接到Patchmaster软件（HEKA Electronics）。

硼硅酸盐玻璃毛细管（WPI）被拉动以在PB / 10拉拔器（Narishige）中制造移液器，记录电极的尖端预先填充1%琼脂-3M KCl溶液并回填3M KCl以防止KCl泄漏到卵母细胞中， 移液器阻力为0.1–0.3 MΩ，由于KCNQ1通道中的门控分量与电压无关。

因此未使用漏电流减法，在含有（mM）96 NaCl、96 KCl、2.1 CaCl 的 ND8 溶液中进行记录2， 1 氯化镁2和 5 HEPES，pH 7.5，通过用氯化钾取代NaCl获得不同的含钾溶液， 含0.2 mM K溶液（单位：mM） 0.2 KCl， 95.8 NaCl， 1.8 CaCl++2， 1 氯化镁2和 5 HEPES。

pH 7.5;100 mM 钠溶液（标称不含钾）含有 100 NaCl、1.8 CaCl++2， 1 氯化镁2和 5 HEPES，pH 7.5，在后一种溶液中，100 mM Na被100 mM K，Rb或NMDG取代以获得相应的溶液，除非另有说明，否则所有化学品均来自Sigma，将卵母细胞记录在体积为0.35ml的腔室中，使用五通道灌注系统交换细胞外溶液。

在所有实验中，以2.5ml / min流速的卵母细胞灌注保持恒定，根据以下程序对卵母细胞进行测量以确定KCNQ1通道的浓度依赖性 ，从孵育溶液中放置表达野生型或突变通道的卵母细胞（补充有Ca的OR2++++2+[2 mM]、丙酮酸钠 [5 mM] 和庆大霉素 [50 mg/ml]）放入记录室中，注入含有 ND0 的 2.96 mM K 溶液。

将卵母细胞钳制在保持电位（通常为-100 mV）后，施加+60 mV幅度和120 s脉冲间隔的连续去极化脉冲，该溶液中的KCNQ1电流幅度通常在随后的四到六个脉冲后稳定下来 ，之后取下一个三个点的值为0.2 mM K++o。

然后，将灌注切换到含2mM K的溶液中，并记录接下来的三个点，按照该方案继续实验，直到最后三个点对应于100 mM K++o被记录下来， 由于某种原因，没有达到100mM K灌注步骤的记录没有被分析。

为了估计非特异性电流，以相同的方式记录来自平行批次的水注入卵母细胞， 这些卵母细胞的记录在同一天使用相同的溶液以及通过应用相同的方案和溶液交换方案完成，然后，我们平均了在特定光标位置采集的三到四个注水卵母细胞的非特异性电流值，这与野生型和突变通道的分析相同。

随后，从每个K的三个数据点中减去这些非特异性电流值++o浓度 ，并将数据与时间作对比，浓度-效应关系是通过平均给定浓度的三个点并校正理论值来确定的，如果没有另行说明，然后使用Igor Pro软件（WaveMetrics）将数据点拟合到希尔方程中。

单声道录音是以前发表的（Werry等人，2013），使用Axopatch 200B放大器，Digidata 1440A和pClamp 10软件（分子器件）进行收购，采集时使用2 dB四极点贝塞尔滤波器对记录进行3 kHz低通滤波。

以10 kHz采样，并在分析前以200 Hz进行数字滤波，对于单通道记录，浴液含有（以mM为单位）135 KCl，1 MgCl2， 0.1 氯化钙2、10 葡萄糖和 10 HEPES（含 KOH 的 pH 7.4），移液器溶液含有（以mM为单位）6 NaCl，129 MES，1 MgCl2， 5 氯化钾， 1 氯化钙2和 10 HEPES（含氢氧化钠的 pH 7.4）或 97 氯化钾、41.3 MES、1 氯化镁2、1.9 氯化钠和 10 HEPES。

使用线性多级电极拉拔器（萨特仪器）从厚壁硼硅酸盐玻璃（萨特仪器）中提取电极，电极涂有西尔加德（道康宁），火抛光后， 单通道电极电阻在 40 到 60 MΩ 之间，n值是指通过TEVC或膜片钳方法记录的单个细胞的数量。

计算电生理学模拟

在GROMACS中实施双膜配置的CompEL（计算电生理学）方法用于研究通过KCNQ1通道孔区域的离子渗透，离子的渗透由跨膜电压驱动，跨膜电压由隔室之间的电荷不平衡（2 Cl离子）产生。

KCNQ1的开态冷冻电镜结构（PDB ID：6V01;太阳和麦金农，2020）去除后 ，KCNE3用于模拟，为了使细胞内门保持开放状态，S5和S6螺旋的末端氨基酸被抑制，蛋白质膜系统通过CHARMM-GUI组装并嵌入被水和K / Na / Cl包围的POPC脂质双层中++−离子，系统最小化并平衡，逐渐释放位置约束，以10 ns的NTP集合平衡结束，文本中的 N 个值是指单独的 MD 模拟的数量。

数据分析

使用Fitmaster（HEKA Electronics），Kaleidograph（Synergy软件） 和Igor pro（Wavemetrics）软件分析数据，野生型和突变型KCNQ1通道的失活是通过拟合具有两个或三个指数函数的尾流来确定的，随后将拟合外推到节段的开头，然后按照以下说明执行比率的计算无花果，从早期出版物中采用。

T312C的电压依赖性激活是通过校正失活后的尾电流确定的，然后将数据拟合到具有偏移量的玻尔兹曼函数，如前所述，浓度-响应数据测定如下：对于每个外部K浓度，从整个去极化段（+60 mV）确定峰值电流 ，然后减去理论值。

假设K，++在= 108 mM，电流幅值和绝对单通道渗透的理论降低PK使用形式为 Ik = P 的戈德曼-霍奇金-卡茨 （GHK） 通量方程计算得出K（VmF2/RT）[Ki − Koexp（−VmF/RT）/（1 − exp（−VmF/RT）]。

其中 PK是绝对的单通道渗透率;Vm 是膜电位;Ki和Ko分别是内溶液和外溶液中的K浓度;Vm 是膜电压;和 F、R 和 T （293 K） 有其通常的含义， 假设通道未被细胞外K修饰，则两个外部K浓度K的电流降低之比K++++o（C1）， K+o（C2）。

由下式给出：Ic1/Ic2 = [K+在（C1） − K+o（C1）exp（−VmF/RT]/[K+在（C2） − K+o（C2）exp（−VmF/RT）] ，其中 K+o（C1）， K+o（C2）， K+在（C1） 和 K+在（C2）是外部和内部K浓度，相应地（Larsen等人，2011），然后用形式为 I（C） = （1 − Imax） + （Imax/（1 + [C/IC +50]nH）。

其中 Imax 是最大抑制，IC50是半极大抑制的浓度，nH是希尔系数，C是浓度，渗透率计算公式为PX/PK= exp（ΔErvZF/RT）， 其中 ΔErv 是细胞外阳离子交换前后逆转电位的平均差，Z、F、R 和 T 具有其通常的含义.

K+o-KCNQ1突变体的敏感性，失活明显降低

我们最初研究了不同[K]的影响+]o在由同源体KCNQ1介导的向外电流上 ，与以前的研究一致（Yang和Sigworth，1998;拉森等人，2011;Wang等人，2015），我们观察到KCNQ1介导的电流在+60 mV范围内显着降低[K+]o介于 0.2 和 100 mM ，将希尔方程拟合到 GHK 校正数据 产生的抑制参数 。

与非洲爪蟾卵母细胞和CHO细胞早期研究中报道的内容相当，活化的同源体KCNQ1通道经历快速失活过程，也称为钩失活。

这个名字起源于复极化电位（−100 mV in），这反映了两个同时进行的过程： 通道从失活中恢复和通道停用，接下来，我们测试了K是否+oKCNQ1的敏感性与快速失活有关， 通过研究先前显示的F351A突变体表现出相当大的失活缺陷（Hou等人，2017）和位于S271段的L5A，也显着减少失活（未发表的数据）。

作为第一步，我们使用一种方法量化这些突变体的失活，该方法在无花果， S1取决于去极化电压 和 激活脉冲的持续时间，结果表明，L271A和F351A通道的电压和时间依赖性失活受到强烈抑制，K 的分析+o这些突变体的依赖性表明它们被K抑制+o在与野生类型。

我们还研究了其他几种表现出不同程度失活的突变体，包括I274A， 其表现出增强的失活，并进行了相关分析，K+o-KCNQ1的依赖性抑制与快速失活的程度无关。

结论

与KCNQ1/KCNE3通道相比，异构KCNQ1/KCNE1通道的构象差异可能归因于这两个通道的上孔区存在明显的构象差异，比较 KCNQ1 和 KCNQ1/KCNE3 通道的可用原子分辨率结构显示 SF 中没有明显的结构差异，这表明剂量-反应曲线的变化可能归因于 SF 的动态特性。

参考文献

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5.科佩克、科普费尔、维克里、邦达连科、詹森、德格鲁特、扎卡里亚2018.脱溶剂化离子的直接敲击控制着K通道中严格的离子选择性+.国家化学.

围绕数据+云构筑创新基石 甲骨文在AI时代开启加速模式

在云和AI的道路上，甲骨文正在加速奔跑。在5月31日结束的2023财年，甲骨文的营业额首次达到500亿美元，第四财季（2023年3月-2023年5月），云（IaaS+SaaS）收入为44亿美金，按美元计算增长54%，按固定汇率计算增长55%，其中，云基础设施（IaaS）的收入为14亿美元，按固定汇率计算增长77%。“数据库和云是甲骨文的双引擎，创新深植于我们的DNA。”甲骨文公司副总裁及中国区董事总经理吴承杨谈到，正是围绕数据和云的不断创新，才推动了甲骨文的业绩高速增长，“今天的Oracle不仅仅是数据库公司，而是云和数据的公司。”

甲骨文公司副总裁及中国区董事总经理吴承杨

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甲骨文公司中国区技术咨询部高级总监李珈

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甲骨文公司中国区技术咨询部高级总监嵇小峰

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